フィールド展開可能なコヒーレントラマン分光法による細菌胞子のスタンドオフ検出

Scientific Reports volume 13、記事番号: 2634 (2023) この記事を引用

573 アクセス

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

振動分光法は、化学兵器や生物兵器のスタンドオフ検出に大きな可能性をもたらし、オペレーターや機器への汚染を回避します。それらの中で、特に有望なのはコヒーレント反ストークスラマン散乱（CARS）分光法です。これは、同期したポンプ/ストークスレーザーパルスを使用して、レーザー焦点でのターゲット分子の振動コヒーレンスを設定し、プローブパルスとのさらなる相互作用によって読み取られ、その結果が得られます。離れた場所でも検出可能なコヒーレントビームの放射。 CARS は、特徴的な分子であるジピコリン酸カルシウム (CaDPA) のラマンスペクトルに基づいて細菌胞子を検出する能力を以前に実証しました。ただし、実験室環境にのみ適した複雑でかさばるレーザー技術が採用されました。ここでは、コンパクトな工業グレードのイッテルビウムレーザーシステムに基づいたブロードバンド CARS セットアップを開発します。濃度 105 cfu/mm2、スタンドオフ距離 1 m、取得時間 1 秒での Bacillus atrophaeus 胞子の高い S/N 比検出を実証します。当社のシステムは、化学的特異性と感度を、堅牢性と携帯性の向上とともに組み合わせたもので、化学的および生物学的脅威を現実世界でスタンドオフ検出するための新世代の機器への道を開きます。

化学兵器および生物兵器のスタンドオフ検出は、軍と国土安全保障の両方にとって関心が高まっているテーマです。光学技術は本質的に非接触であり、オペレータや機器への潜在的な汚染を回避できるため、この点で大きな期待が寄せられます。ただし、必要な感度と特異度に達するには、検出が困難になります。紫外線励起によるレーザー誘起蛍光 (UV-LIF) は広く使用されている技術であり、励起に高エネルギーのレーザーパルスを使用すると高い信号強度を得ることができます 1,2。しかし、それはかなり非特異的であり、生物因子の蛍光スペクトルは特徴がなく、環境で発生する他の有機物質のスペクトルと類似していることが多いため、生物因子の識別は困難である可能性があります3。レーザー誘起破壊分光法 (LIBS) は、高エネルギーレーザーパルスを使用してサンプルをプラズマに分解するもう 1 つの検出方法です。これにより、特有の周波数で光が放射され、元素組成 (イオン、原子、分子フラグメント) の決定が可能になります。）。 LIBS シグナル強度やこの手法に固有のサンプル損傷の問題以外に、生物学的因子はその増殖方法や取り扱い方法に応じて元素含有量に大きなばらつきがあり、それが LIBS の特異性を制限し、範囲を狭くすることに注意する必要があります。生物学的因子の検出における適用範囲4,5。光音響分光分析は、スタンドオフ距離で爆発の危険性を検出できる可能性を示した新興技術ですが、現在は感度が低いために制限されています6。一方、振動分光法は、化学的特異性と感度の必要な組み合わせを提供すると約束されています。振動スペクトルは分子の構造を反映し、利用可能な内因性および化学的に特異的な特徴を提供します7。

ラマン分光法は、分子振動を測定するための一般的な実験方法です。これは、ターゲット分子による光子の非弾性散乱に基づいており、分子の振動モードのエネルギーに対応する周波数シフトを持つ散乱光を返します8、9、10、11、12。、13、14。自発ラマン (SR) では、周波数 \(\omega _{pu}\) の単色ビームが周波数 \(\Omega \) の熱分子振動と相互作用し、周波数 \(\omega) の非弾性散乱 (ストークス) 光を生じます。 _{S}\) = \(\omega _{pu}\) − \(\Omega \)。プロセスの自発的な性質により、SR 光は弱く、空間的にインコヒーレントで、全方向に放射されるため、スタンドオフ検出は非常に困難になります 15,16。この制限は、一連の光パルスを使用してレーザー焦点における分子集合内の振動コヒーレンスを設定および検出する三次非線形分光法技術の一種であるコヒーレント・ラマン散乱（CRS）によって克服できます。 CRS は、周波数 \(\omega _{pu}\) と \(\omega _{S}\) の 2 つのパルス、ポンプとストークスを組み合わせて、振動周波数 \(\ Omega \) = \(\omega _{pu}\) − \(\omega _{S}\) はポンプ・ストークス周波数の差と一致します。

最も広く採用されている CRS 技術は、コヒーレント反ストークスラマン散乱 (CARS)17,18,19 です。この手法では、周波数 \(\omega _{pr}\) のプローブパルスとのさらなる相互作用によって振動コヒーレンスが読み取られます。反ストークス周波数 \(\omega _{aS}\) = \(\omega _{pr}\) + \(\Omega \) でコヒーレント放射を生成します。これによれば、関連するアンチストークス信号は本質的に周波数領域でプローブから分離されており、スペクトルフィルタリングによって効果的に検出できます。これはCARSの重要な利点です。一方、CARS 分光法は、いわゆる非共鳴バックグラウンド (NRB) の影響を受けます。NRB は、非共鳴 3 次非線形波を媒介として、ポンプ、ストークス、プローブ間の 4 波の混合によって生成される信号です。ターゲット分子と周囲の媒体の感受性。多くの場合、NRB は共振信号よりもはるかに強力であり、広い広帯域プラトーを提供することに加えて、振動の線形を大きく歪める可能性があります。

(A) ポータブルレーザーシステムによる細菌胞子のスタンドオフ検出。挿入図は、細菌胞子を検出するためのラマンマーカーであるジピコリン酸カルシウムの自発ラマンスペクトルを示しています。 (B) ポンプ、ストークス、およびプローブレーザーパルスの生成、および (C) スタンドオフ構成での後方散乱 CARS 信号の励起/収集のためのシステムのレイアウト。

NRB は仮想状態との非共鳴相互作用のみに依存するため、ポンプ、ストークス、プローブパルス間の時間的重複が必要ですが、いわゆる時間遅延 CARS (TD-CARS) では大幅に低減、または完全に抑制することさえできます。 20、21では、プローブパルスがポンプ/ストークスに対して遅延しています。 CARS (FAST-CARS) によるフェムト秒適応分光技術として知られる TD-CARS のバージョンは、有害な炭疽菌の模倣菌である細菌 Bacillus subtilis22,23 の内生胞子などの生物学的因子の検出に適用され、成功しました。胞子の特徴である分子ジピコリン酸カルシウム (CaDPA) のラマン署名。しかし、これまでの実験は、Ti:sapphire 技術をベースにした複雑でかさばるレーザーシステムに依存していました。このシステムは実験室環境には適していますが、現場での展開には向いていません 22,23,24,25,26,27,28,29 、30。最近、私たちのグループは、Ybファイバーレーザーとインパルス刺激で同時にポンプとストークスとして機能する広帯域パルスを生成するための中空コアファイバーを使用したTD-CARSによる液体化学物質のスタンドオフ検出のセットアップを実証しました。ラマン散乱構成３１．この設定を使用すると、励起エネルギーは主にラマンスペクトルの低周波部分に送られますが、1000 cm-1 を超える周波数でのラマンモードの励起と検出にはごく一部のみが効果的に使用されるため、より多くの用途に適用することができませんでした。粉末や生物材料などの扱いにくいサンプル。このため、有望な結果にもかかわらず、CARS 分光法に基づく病原体のスタンドオフ検出はまだ現実世界のアプリケーションに応用されていません。

この論文では、コンパクトさ、携帯性、エネルギー/電力の拡張性を備えた堅牢な工業グレードのイッテルビウムレーザーシステムを中心とした広帯域 TD-CARS セットアップを設計し、それを細菌のスタンドオフ検出に適用することで、この方向に一歩前進します。胞子 (図 1A)。我々は、1 秒の取得時間で 105 cfu/mm2 の濃度で高い信号対雑音比 (SNR) で、その特徴的な分子 CaDPA を介して、スタンドオフ距離 1 m でバチルス・アトロファウスの胞子を検出することを実証します。当社のシステムは、CARS 分光法の感度と特異性を携帯性の向上と組み合わせ、生物剤および化学剤の新世代のスタンドオフ検出システムへの道を開きます。

スタンドオフ検出に使用した実験設定を図 1B に示します。これは、増幅された Yb:KGW レーザー (Pharos、光変換) から始まり、1025 nm (基本波長) および 1 kHz の繰り返し率で 250 μJ、250 fs パルスを生成します。 3 つの別々のブランチが Yb レーザーから派生し、CARS 相互作用のポンプ、ストークス、およびプローブとして使用されます。最初のブランチは光パラメトリック増幅器 (OPA) の出力で、Yb レーザーの第 2 高調波 (SH) によって励起され、白色光連続体 (WLC) によってシードされます。 910 nm で 12 μJ (12 mW) のポンプパルスを提供し、半値全幅 (FWHM) 帯域幅は 35 nm (420 cm-1) で、プリズムペアによって持続時間は 30 fs に圧縮されます。 2 番目のブランチは、1025 nm で 90 μJ (90 mW) のパルスエネルギーを持ち、SH 生成後の基本ビームの残留物であり、 \(\sim \)7 nm (70 cm−1) のストークスパルスを与えます。 ) FWHM 帯域幅。最後に、3 番目のブランチは、OPA 相互作用後に変換されずに残された SH の 512.5 nm での 120 μJ エネルギーで始まり、ゼロ分散パルス整形器でスペクトル的に狭められ、 \(\sim で 9 μJ (9 mW) のプローブパルスを提供します。 \)0.2 nm (8 cm−1) FWHM 帯域幅。 OPA レーザー光源の詳細な説明と特性評価は、他の場所で見つけることができます32。

ポンプ、ストークス、プローブパルスのスペクトルを図 2A に示します。ポンプパルスの中心波長は、OPA内のSHパルスとWLCシード間の遅延に作用することで調整できますが、本アプリケーションでは、1250cm-の周波数差を提供するために910nmに設定されています。 1025 nmのストークスパルスに関して。ポンプとストークスパルスの \(\sim \)500-cm\(^{-1}\) の畳み込み帯域幅を考慮すると、これにより 1000 ～ 1500 cm−1 の範囲のモードを効率的に励起できるようになり、分子の特性評価に必要な指紋領域の広い部分。ポンプ、ストークス、プローブのパルスは遅延線によって同期され、ダイクロイックビームスプリッターによって共線的に結合されます。次に、球面ミラーによって、1 m のスタンドオフ距離に配置されたターゲットサンプル上に焦点が合わせられます (図 1C を参照)。ターゲット上の 3 つのレーザービームの \(1/e^2\) 直径は 360 μm です。後方散乱された CARS 信号は 2 インチで収集されます。焦点距離 150 mm のレンズを使用し、増倍 CCD カメラを備えた分光計の入口スリットに焦点を合わせます。ここで紹介するレーザーシステム (Yb レーザーと OPA) の体積はほぼ 1 m × 1.5 m × 0.3 m、重量は 80 Kg、消費電力は \(\sim \)1.6 kW です。市販の mJ クラス Yb レーザーに統合された OPA モジュールを使用すると、設置面積を大幅に削減できます。

図 2B は、CARS 信号の生成に関与するエネルギーレベルのスキームを示しています。広帯域同期ポンプとストークスパルスが仮想レベルと相互作用して、レーザー焦点内の分子の集合体に振動コヒーレンスを生み出し、同時に多数の振動を励起します。このコヒーレンスは、周波数 \(\omega _{pr}\) の狭帯域プローブパルスによって読み取られ、反ストークス周波数 \(\omega _{aS}=\omega _{pr}+) のスペクトルが生成されます。 \オメガ_{i}\)。 TD-CARS では、プローブのパルスはポンプやストークスと同期する必要はありませんが、振動コヒーレンスの減衰時間に匹敵する遅延 \(\tau \) で発生する可能性があります。この場合、周波数 \(\Omega _{i}\) での CARS 信号の強度は \(e^{-2\tau /T_{2vi}}\) としてスケールされます。ここで \(T_{2vi} \) は、\(\Omega _{i}\) におけるモードの振動ディフェーズ時間です。前述したように、CARS 信号は NRB に重畳され、CARS ピークと重なり、信号が非常に強い場合には線形を歪めることさえある、広範囲で特徴のないスペクトルに寄与します。 NRB はポンプ、ストークス、プローブのパルスの時間的オーバーラップを必要とするため、ポンプ/ストークスに対してプローブを遅延させることで大幅に軽減できます。プローブパルスの遅延を調整することにより、検出されたCARS信号を最適化し、振動ピークの強度と可視性との間の妥協点を達成することができる。

(A) CARS 信号の生成に使用されるポンプ、ストークス、およびプローブパルスのスペクトル。ポンプとストークスの中心周波数と帯域幅によって、ターゲット内で励起されるラマン周波数の範囲が決まります。プローブの帯域幅によって、CARS スペクトルの最終分解能が決まります。 (B) 広帯域 CARS 検出に含まれるエネルギーレベルと遷移のスキーム (実線または点線のエネルギーレベルは、それぞれ実際のレベルまたは仮想レベルを指します)。 P: ポンプ。 S：ストークス。 pr: プローブ; AS: アンチ・ストークス。

バチルス属の胞子には、対象となる種に応じて、乾燥胞子質量の約 15 ～ 20\(\%\) を占める分子である CaDPA が豊富に含まれています33。これによると、内生胞子のラマンスペクトルは、659、824、1017、1395、1446、1572 cm\(^{-1}\)34,35 の CaDPA の振動モードによって支配されています (図 1A を参照)。スタンドオフ測定では、まず圧縮ジピコリン酸ナトリウム (NaDPA) 粉末のサンプルを使用してシステムを最適化しました。NaDPA は、ほぼ同じラマンスペクトルを持ち、合成が容易な CaDPA の代替品です。この後、溶融シリカプレートの表面に堆積させたB.アトロファウス胞子のサンプルに切り替えました。

図 3A は、積分時間 100 ms、スタンドオフ距離 1 m で測定した NaDPA 粉末の周波数とプローブ遅延の関数としての CARS スペクトログラムを示しています。ポンプ、ストークス、プローブパルスのエネルギーはそれぞれ 4、4、3 μJ です。 1.5 ps のプローブ遅延では、NRB は大幅に減衰し、指紋領域内の NaDPA の特徴的なラマンピークのほとんどすべてが分解されます。周波数軸は、純トルエンの 786、1004、および 1210 cm\(^{-1}\) (3 点線形フィット) で測定されたラマンピークを参照しています。 1004 cm\(^{-1}\) のピークの FWHM は 8 cm\(^{-1}\) であり、これは CARS スペクトルの達成可能な分解能の測定値となります。 NaDPA 粉末の振動周波数の決定の精度は、マイクロラマン分光計からのデータと比較して ±2 cm\(^{-1}\) であり、CARS 特徴の歪みと周波数シフトの影響が、粒子の干渉によるものであることが確認されています。 NRB は 1.5 ps のプローブ遅延では無視できます。興味深いことに、分子振動が存在しない領域である 1220 cm\(^{-1}\) でのスペクトログラムの水平断面 (図 3B を参照) は、ポンプ/ストークスと分子間のコンボリューションの測定値を提供します。 FWHM持続時間が1.8 psのプローブパルス。ポンプパルスとストークスパルスの持続時間 (それぞれ 30 と 250 fs) を考慮すると、結果として得られるプローブパルスの持続時間は \(\sim 1.5\) ps となり、FWHM 帯域幅 0.25 nm (9.5 cm\(^ {-1}\))、CARS スペクトルで観察された分解能と一致する、プローブスペクトルのガウスプロファイルを仮定します。表 1 は、CARS 測定値と対応する割り当てから計算された NaDPA の振動周波数を示しています。

図 3C に示す CARS 信号に寄与する NaDPA 粉末の量は、サンプル密度 0.73 g/cm3、サンプル上のレーザービーム直径 300 μm、および有効レーザー侵入深さを 10 μm と仮定します37。これらの条件下では、1007 および 1395 cm\(^{-1}\) の主なラマンピークで観察される SNR は \(\sim \)280 です。後方散乱 CARS 信号の SNR の濃度スケーリング則は、プレス粉末サンプルでも二次関数 (\(\propto N^2\)、N は分子の数) であることが示されている 38。 NaDPA の量を 100 ng (つまり 10 倍) にすると、SNR \(\sim 3\)、つまり NaDPA のラマンシグネチャがほとんど見えない状態になります。ただし、SNR は CCD カメラセンサーの積分時間 (\(\propto \sqrt{n}\)、n は蓄積されたスペクトルの数) に平方根依存するため、積分時間を増やすことで改善できます。 100ミリ秒から1秒まで。これにより、SNR が \(\sim 10\) に回復します。つまり、バックグラウンドに対する NaDPA ラマンシグネチャの識別には十分に良好です。この推定値は、次のセクションで示す細菌胞子で得られたスタンドオフ CARS の結果と一致しています。

(A) NaDPA 粉末のスタンドオフ CARS スペクトログラム。ポンプ、ストークス、およびプローブのパルスエネルギーは、それぞれ 4、4、および 3 μJ です。胞子サンプルはレーザーシステムから 1 m の距離に配置され、積分時間は 100 ms です。 (B) 1220 cm\(^{-1}\) のラマンシフトにおける水平断面図 (灰色の線) は、プローブのパルス幅の測定値を提供します。 (C) プローブ遅延 1.5 ps での垂直断面図 (赤線) は、NaDPA の広帯域スタンドオフ CARS スペクトルを示します。マイクロラマン分光計で取得した NaDPA 粉末のラマンスペクトル (緑色の線) 36。

(A) B. アトロファウス胞子のスタンドオフ CARS スペクトログラム。ポンプ、ストークス、およびプローブのパルスエネルギーは、それぞれ 12、12、および 9 μJ です。胞子サンプルはレーザーシステムから 1 m の距離に配置され、積分時間は 1 秒です。 (B、D) B. アトロファウス胞子のスタンドオフ CARS スペクトログラムの断面図 (実線) と、プローブ遅延 0.5 および 1.5 ps の ALS フィッティングプロファイル (破線)。 (C、E) CaDPA の対応する残差と参照ラマンスペクトル (マゼンタ線)。残留物は、B. atrophaeus 胞子の広帯域 CARS フィンガープリントを表します。

B. atrophaeus 胞子のスタンドオフ CARS スペクトルを図 4 に示します。胞子サンプルをレーザーシステムから 1 m の距離に再度配置しますが、積分時間は 1 秒に増加します。図 4A は、0.5 ～ 2.1 ps のプローブ遅延に対応するスペクトルを示しています。これは、胞子の CARS 特徴が最もよく観察されるウィンドウです。共鳴寄与は、NRB (非対称最小二乗フィット、ALS39) をフィッティングし、そのフィットを生のスペクトルから減算することによって取得されます。図 4B、D は、それぞれ 0.5 および 1.5 ps で取得されたスペクトルとその ALS フィットを示しています。取得された胞子の共鳴CARSスペクトルを図4C、Eに示します。

0.5 ps では、ポンプ、ストークス、プローブのパルスがよく重なり、胞子ラマン共鳴の強度は比較的強く、特に 1017、1395、1445 cm\(^{-1}\) では SNR が大きくなります。 80以上が観察されています。このトリプレットは、自信を持って CaDPA40、41 に起因すると考えられる固有の周波数の組み合わせを提供し、SNR が高いため、自動ソフトウェアルーチンによるマーカーの分類に容易に使用できます。ここでの共鳴寄与は NRB との干渉によって歪められ、ラマンピークの分解能が低下しているように見えることに注意してください。

プローブパルス遅延が 1.5 ps の場合、より高いスペクトル品質と分解能が得られます。 NaDPA の測定で示されるように、この場合、NRB との干渉は減少し、分解能は最終的にプローブパルスの 8 cm\(^{-1}\) 帯域幅によって制限されます。これは、図 4E の CARS スペクトルによって確認されており、1004 および 1018 cm\(^{-1}\) の二重線がよく分解されています。 1004 cm\(^{-1}\) の線は胞子タンパク質のフェニルアラニンによるものであり、1017 cm\(^{-1}\) の線は「呼吸」モードによるものであるため、このダブレットは細菌の胞子に特有です。 CaDPA分子中のピリジンの反応41。 1087 cm\(^{-1}\) (ピリダイン: 三角環呼吸、または DNA:OPO\(^-\) 伸縮)34、42 および 1195 cm\(^{-1}\) ( CaDPA: CH ベンド)36 は、胞子のラマンフィンガープリントの認識に関する追加の詳細を提供します。 1557 cm\(^{-1}\) の鋭いラマンラインは、大気中の酸素 (O\(_2\)) によるものです。ただし、この遅延では、ラマン信号の振幅は \(\sim \)4 の係数で減少します (図 4C、E と比較)。これは、一方では振動の位相ずれが原因であり、他方ではNRBによるヘテロダイン増幅効果の減少。したがって、周波数分解能のスペクトル強度を考慮してプローブ遅延を慎重に最適化する必要があります。

NaDPA 粉末と同様に、CARS シグナルに寄与する胞子中の CaDPA の量も推定できます。平均して、B. アトロファウスの単一胞子の核には 49 fg の CaDPA 塩が含まれています。これは、乾燥胞子の質量が 328 fg43 であり、CaDPA の相対質量は一般に約 15\(\%\) であると想定されているためです。。 B. アトロファウスの胞子の平均体積は 0.27 μm343 と予想されるため、堆積サンプルの最密充填胞子の有効体積は 1 μm3 であると仮定しました。これによると、レーザービームで調べた体積 (\(1.4\times 10^6\) μm3) 内に含まれる胞子の数は \(1.4\times 10^6\) と推定され、これは 70 ng のCaDPAはCARSシグナルに寄与します。図 4E によれば、これは 1018 cm\(^{-1}\) のメインピークで 20 の SNR を提供します。これは、NaDPA の結果から外挿されたデータとほぼ一致しています。

生物兵器のスタンドオフ検出のための実際の用途では、高感度で細菌胞子を検出する必要があります。この目的のために、CARS システムのパルス波長の最適な組み合わせにより信号強度を向上させました。一方では、ポンプ/ストークス準備パルスに 920/1030 nm の近赤外波長を使用しました。これにより、特に強い 30 fs ポンプパルスの存在下で、胞子サンプルを破壊することなく、より高いエネルギー (フルエンス) が可能になります。したがって、CARS 信号がより強くなります。一方、512.5 nm の可視プローブパルスを選択すると、\(1/\lambda ^4\) レイリー散乱則に従って近赤外に対する散乱効率が向上し、さらに CARS がシフトします。信号は 480 ～ 490 nm の範囲にあり、増倍 CCD カメラの効率が最も高くなります。いくつかのスペクトル特徴の観察によりラマンシグネチャの認識が向上するため、信号強度に加えて、広帯域動作も特異性を向上させるために重要です。私たちのシステムで使用した準備パルスは、500 cm\(^{-1}\) の結合バンドを提供します。これは、細菌胞子の指紋領域のほとんどに対応し、マーカーを確実に検出できるようにします。

スタンドオフ距離での操作の場合、ターゲット距離の変動に対する感度を下げるために、大きな焦点深度が必要です。私たちの設計では、ターゲット上の 3 つのビームすべてに 360 μm という比較的大きなビーム直径を使用することで、ターゲットの位置に関する要件を緩和します。これは、1025 nm のストークスビームのレイリー範囲 \(\sim \)0.1 m に相当します。乖離が大きくなります。焦点深度がストークスビームのレイリー範囲の 2 倍であると仮定し、ターゲット距離 1 m を考慮すると、ターゲット位置に対する許容誤差は ±10\(\%\) になります。これは、スタンドオフ CARS システムではほぼ許容可能です。信号強度は、法則 \(I_{CARS}\propto I_{pu}\times I_{S} \times I_{pr}\) に従って、ポンプ、ストークス、およびプローブの強度の積に比例します。 FAST-CARS 分光法を使用した細菌胞子検出のための以前の最先端システムは、直径 40 μm、ターゲット距離 10 cm までのレーザーの強力な集束に基づいており、結果としてターゲット位置に対する許容誤差は ±1% でした23。。

さらに、サンプル上に比較的大きなビーム直径を採用することで、フルエンスとピーク強度を損傷閾値より十分に低く保ちながら、パルスエネルギーを増加させることができ、その結果、分光計によって収集されるCARSエネルギーが増加します。より具体的には、図 4 に示すスタンドオフ CARS スペクトルは、パルス幅 30 fs でフルエンス 0.024 J/cm2 および強度 0.7 × 1012 W/cm2 に相当する 12 μJ のポンプパルスエネルギーを使用して測定されました。は、フルエンスと強度についてそれぞれ 0.2 J/cm2 および 3 × 1012 W/cm2 と報告されている胞子損傷閾値を大幅に下回っています23。胞子サンプルによって拡散された CARS 放射線は、1 m の距離で焦点距離 10 cm のレンズによって収集され、分光計の入力に結像される CARS ビームの直径は 39 μm であり、ほぼ完全に受け入れられることに注目します。分光計入力スリットにより、0.2 nmのスペクトル分解能を達成します。

光学技術は、生物学的脅威の迅速なスタンドオフ検出に大きな期待をもたらし、ユーザーが危険から安全な距離を置いて操作できるようにします。特に CARS 分光法は、ラマン分光法の分子特異性と一貫した技術によってもたらされる高い信号レベルを組み合わせており、細菌胞子を分類する機能がすでに実証されています。ただし、この技術を実際に適用するには、感度の向上が必要であり、現場での展開に合わせてシステムを設計する必要があります。私たちの研究では、コンパクトで頑丈な工業用グレードの Yb レーザーから始まる細菌胞子検出用の光学システムを設計しました。これは、実験室からより現実世界の環境での動作への移行に向けた一歩です。プロセスを最適化し、胞子の光損傷を防ぎながら検出される CARS 信号の強度を最大化するために、ポンプ/ストークス/プローブビームの波長をさらに選択しました。このシステムを使用すると、スタンドオフ距離 1 m で、濃度 105 cfu/mm2 の B. アトロファウス胞子を、信号対雑音比 20、取得時間 1 秒で検出できました。

私たちの実験はこれまで、駆動レーザーからの 250 μJ の中程度の出力エネルギーで実行されてきました。同様の全固体 Yb 技術を使用すると、出力エネルギーを容易に 1 桁以上増加させることができ、胞子の損傷閾値に達する前に生成される CARS 強度を 3 桁近く増加させることができます。生成されるCARSパルスエネルギーのさらなるスケーリングは、サンプルでのビーム直径を大きくすることによって達成できます。スタンドオフ距離 d による CARS 信号の \(\propto 1/d^2\) スケーリングを考慮すると、検出距離が 1 桁以上、数十メートルの範囲まで増加すると予想できます。機械学習 (ML) アルゴリズムを使用してスペクトルを処理すると、感度がさらに向上します。 ML は、環境迷光やサンプルと基板の特性の固有の変動などの干渉因子の存在下で、特定の化学指紋を分類できます。当社のスタンドオフ CARS システムは、化学兵器の検出、またはより一般的には環境検知にさらに拡張できます。

ジピコリン酸 (DPA、CAS n. 499-83-2) は Sigma Aldrich から入手しました。ジピコリン酸ナトリウム (NaDPA) は、DPA と化学量論量の水酸化ナトリウム (NaOH、CAS n. 1310-73-2) から調製され、DPA 粉末と混合する前に蒸留水で希釈されました。 250 mM NaOH/DPA 水溶液を 30 °C で数時間蒸発させた後、容器の壁に形成された NaDPA 結晶を粉砕して微粉末にし、円筒形のプレス金型に入れてプレスします。スタンドオフCARS実験に使用する固体サンプルを得るために、10トンの油圧プレスによって。プレスされた NaDPA サンプルの密度は、重量 240 mg、直径 12.70 mm、厚さ 1.30 mm から計算すると \(\sim \)0.73 g/cm3 です。

胞子の種ストックをトリプトン大豆寒天 (TSA) プレートに接種し、37 °C で一晩インキュベートしました。個々のコロニーを10 mlのL-ブロスに採取し、37℃で一晩インキュベートしました。このスターター培養物を、レイトン・ドイ胞子形成培地（ＬＤ）のより大きなフラスコ（フラスコあたり２００ｍｌのＬＤを含有する５００ｍｌフラスコ）に接種するために使用した。これらを 30 °C、160 rpm で 7 日間インキュベートしました (栄養細胞を培養し、その後細胞が胞子形成する時間を与えるため)。胞子を8000 rpm、4℃で10分間遠心分離してペレット化し、その後蒸留水に再懸濁しました。次いで、胞子を遠心分離により３回洗浄し、上記のように蒸留水に再懸濁した。最終的な胞子調製物を必要な濃度になるまで蒸留水に再懸濁し、4 °C で保存しました。胞子濃度は、TSA プレート上に希釈液をプレーティングし、37 °C で一晩インキュベートし、その後コロニーを計数することによって計算されました。倍率 100 倍の油浸位相差顕微鏡でアリコートの胞子を分析したところ、栄養細胞はほとんどなく、ほとんどが胞子であることがわかりました。

この研究で使用および分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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著者らは、契約番号 DSTLX-1000131285 および DSTLX-1000132350 に基づく英国国防省からの資金提供を認めています。

ミラノ工科大学物理学科、Piazza Leonardo da Vinci 32、20133、ミラノ、イタリア

ニコラ・コルッチェリ、パオロ・ラポルタ、ジュリオ・セルッロ

Institute of Photonics and Nanotechnology-CNR、Piazza Leonardo da Vinci 32、20133、ミラノ、イタリア

ニコラ・コルチェッリ、ジャンルカ・ガルツェラーノ、パオロ・ラポルタ、ジュリオ・セルッロ

防衛科学技術研究所、ポートンダウン、ソールズベリー、英国

ケリー・カーティス、クレア・L・ロンズデール、デビー・パッドジェン、クリストファー・R・ハウル

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NC は論文を考案し、実験を実施しました。 KC、LCL、DP、CH は胞子サンプルを提供しました。 NC、GG、PL、KC、LCL、DP、CH、および GC 分析データ。 NC と GC が論文を執筆しました。著者全員が原稿の準備に協力してくれました。

ニコラ・コルッチェリへの手紙。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Coluccelli、N.、Galzerano、G.、Laporta、P. 他。フィールド展開可能なコヒーレントラマン分光法による細菌胞子のスタンドオフ検出。 Sci Rep 13、2634 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-29589-7

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受信日: 2023 年 1 月 9 日

受理日: 2023 年 2 月 7 日

公開日: 2023 年 2 月 14 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29589-7

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